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1. 서 론

음식물에서 발생하는 향기는 음식의 맛과 신선도를 판단하는데 중요한 인자로 작용한다. 이러한 향기의 구성 성분들은 다양한 종류를 포함한 화합물들의 형태로 매우 극미량 수준으로 존재한다. 그러나, 미량의 범위 내에서도 그 농도의 차이에 따라 인체가 감지하는 맛과 냄새의 종류는 달라질 수 있다.¹⁾ 이러한 음식물의 냄새 특성을 실제로 이용하는 사례는 다양하다. 예를 들어, 과일이 가장 잘 익었을 때의 냄새 성분을 규명하여, 수확 시기를 조절하는데 활용하기도 한다.²⁾ 이와 반대로 신선한 상태의 음식물도 시간이 흐르면서 대기중 미생물 오염에 따라 부패 과정을 거치면서, 여러 종류의 휘발성 화합물들이 발생하고 소멸하는 것과 같이 농도 변화와 함께 다양한 냄새물질들을 배출한다. 

음식물의 종류에 따라 미생물에 의한 부패 과정에서 발생하는 악취 성분들의 조성에는 현저한 차이가 존재 할 수 있다. 음식물의 부패는 음식물의 구성성분, 탄수화물, 지방, 단백질의 구성성분에 따라 대기중 미생물의 오염 및 미생물 성장에 따른 대사산물, 특히 악취물질의 특성이 결정된다. 일반적으로 잘 알려진 황화수소 등을 위시한 환원황화합물이나 트라이메틸아민, 암모니아와 같은 질소계화합물들과 같은 냄새성분들의 배출은 대부분 단백질 성분의 분해에 따라 두드러지게 나타난다.³⁾ 최근에는 이러한 성분들과 더불어, 음식물 발효시 지방의 분해에 따른 아세트알데하이드 및 i-발레르알데하이드와 같은 알데하이드 성분들도 악취기여도가 상당히 높은 물질로 평가받고 있다.⁴⁾ 이처럼 다양한 배출특성을 보이는 부패 악취의 원인 성분을 규명하기 위하여, 다양한 관점에서 악취유발 물질들의 발생특성을 조사하기 위한 시도가 이루어지고 있다.⁵⁾ 또한 이와 같은 연구 결과들은 음식물로부터 발생하는 다양한 부패 악취의 저감을 유도하기 위한 참고자료로 활용하고 있다.⁶⁾ 

본 연구에서는 음식물의 부패 과정에서 발생하는 악취 성분들의 배출특성을 시간의 함수로 연계하여 미생물의 오염 및 성장과 비교분석하고자 하였다. 이를 위하여, 일반 생활환경에서 흔히 접할 수 있는 음식물의 부패 악취를 유발하는 원인 음식물의 하나로 삶은 계란을 선택하여, 냄새물질의 발생특성을 시간의 함수로 조사하였다. 이에 따른 미생물의 오염도 및 성장에 따른 대사관계를 규명하였다. 삶은 계란은 부패하는 과정에서 미생물에 의한 단백질의 분해에 따라 황화수소와 같은 황화합물들을 집중적으로 발생시키는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서 황화수소와 같은 악취(냄새)물질의 특성을 기술하는데 주로 활용하기도 한다.⁷⁾ 따라서 신선하게 삶은 계란 시료를 총 9일의 기간에 걸쳐 신선한 상태로부터 미생물에 의한 부패에 이르는 단계까지 시간의 경과에 따라 발생 가능한 여러 종류의 악취물질들에 대해 배출특성을 조사하고자 하였다. 이를 위하여, 악취방지법에서 지정한 22가지 지정악취물질⁸⁾ 및 기타 주요 악취물질들 (carbon disulfide, benzene, formaldehyde)을 조사대상으로 설정하고, 시간의 경과에 따른 농도 변화를 파악하고자 하였다 (Table 1). 이러한 개별악취물질들에 대한 정량적인 농도 자료를 산출하기 위하여, 각 성분에 적합한 기기분석법을 적용하였다. 또한 신선한 단계에서부터 미생물 부패가 진행할수록 인체가 체감하는 악취물질에 대한 감지 특성을 진단하기 위하여 공기희석관능법을 통한 복합악취의 희석배수를 추가로 조사하였다. 이처럼 기기분석법과 공기희석관능법을 동시에 적용함으로써, 계란의 부패과정에서 발생하는 여러 가지 냄새물질들의 발생 특성을 다각도로 평가하고자 하였다. 

Table 1. A list of offensive odorants and reference compounds investigated in this study

2. 실험 방법

2. 1. 음식물의 준비 및 시료채취

본 연구에서는 음식물 부패시 시간의 경과에 따라 변화하는 악취 성분들의 경향성을 비교해 보고자 하였다. 이를 위하여, 주거지역 인근의 대형 마트에서 국내산 날계란을 구입하고, 냄비에 넣어 약 15분간 끓는 물에 삶아주었다. 이후에 삶은 계란이 상온과 비슷한 온도까지 떨어졌을 때, 약 8조각 정도로 잘라내어 50 g에 근사한 수준의 시료를 확보하였다(Table 2). 이렇게 확보한 삶은 계란 시료는 약 750 mL 부피의 임핀저내에서 9일 동안 보관하며, 특정기간 (0 (계란을 삶은 당일), 1, 3, 6, 9일)의 경과 시점에 임핀저에 일정 (100 mL/min) 유속으로 고순도 공기를 주입 통과시켜 주는 방식으로 시료채취를 진행하였다. 실험을 진행하는 동안 시료를 넣은 임핀저를 물이 담긴 알루미늄 수조에 고정시키고, 온도조절기를 이용하여 물의 온도를 25^oC로 일정하게 유지시켰다 (Fig. 1). 시료를 채취하는 순간에는 임핀저 전단에 고순도의 공기를 일정 유속(100 mL/min)에서 100분간 주입하면서, 후단에 연결한 10 L 용량의 polyester aluminum bag (PEA bag; TOP Trading Eng., Korea)으로 채취하였다. 이를 이용하여 시료가 신선한 단계에서 부패하는 과정을 거치며 발생하는 냄새물질들을 백에 채취하여, (VOC와 VFA를 제외한) 전체 조사대상 성분(RSC, Aldehyde, NH₃, TMA) 의 기기분석 및 공기희석관능법에 활용하였다. VOC와 VFA의 분석은 백 방법 대신 흡착튜브 방식으로 시료를 채취하고 분석하는 방식으로 접근하였다. 이를 위하여, 임핀저 전단에 고순도(99.999%) 질소 가스를 50 mL/min의 유속으로 흘려주면서, 후단에는 고체흡착제를 채운 흡착관을 연결하여 시료를 채취하였다. 시료를 채취하지 않을 때는 임핀저의 전단과 후단을 모두개방하고, 주변 공기가 임핀저 내로 자유롭게 출입할 수 있게 호기성 부패 환경을 유지해 주었다. 악취 시료의 채취와 함께 미생물의 오염 및 성장정도를 측정하기 위하여 대기 시료채취와 함께 1 g의 삶은 계란을 시료로 채취하였다.

Table 2. Information of target food sample and sample code prepared for this study

Fig. 1. Illustration of sampling device and impinger system used for the collection of gas samples released from food samples. 1. Pure air gas cylinder; 2. Air flow regulator; 3. Impinger bottle (750 mL); 4. Glass tubing with a bubbler tip; 5. Aluminum container; 6. Water heated to 25^oC; 7. Heater; 8. Sensor; 9. Temperature regulator; 10. Pieces of boiled egg (50 g); 11. 10 L polyester aluminum bag.

2. 2. 개별악취물질들의 기기분석 방법

본 연구에서는 총 5가지의 분석시스템을 활용하여 총 27개의 성분들과 D/T-ratio 등을 위시한 기타 관련 변수들을 측정하였다. 조사 대상으로 선정한 성분들의 분석에 적용한 기기들의 검출한계 (Method detection limit; MDL) 및 상대표준오차 (Relative standard error; RSE)를 Table 1에 제시하였다. 

2. 2. 1. Reduced sulfur compounds (RSC)의 분석

환원황화합물 (Reduced Sulfur Compounds; RSC)의 분석을 위해, 5가지 RSC 성분들(H₂S(황화수소), CH₃SH(메틸메르캅탄), DMS (황화메틸), CS₂ (이황화탄소), DMDS (이황화메틸))를 주 분석 대상으로 설정하였다. 이들을 고감도로 검출하기 위한 목적으로 GC (CP-3800, Varian, USA) - PFPD (Pulsed flame photometric detector; Varian, USA)와 저온농축열탈착시스템 (Thermal desorber (TD), Unity, Markes International, Ltd, UK)을 연계한 분석 시스템을 활용하였다. TD 내에 Carbopack B와 Silica gel을 1.5 : 2.5의 부피비로 혼합한 Cold trap (CT)을 장착하고, -15^oC에서 시료들의 저온농축을 유도하였다. CT에 흡착한 황화합물들은 250^oC의 고온에서 탈착하여 GC의 BP-1 column (film thickness: 5 μm, diameter: 0.32 mm, length: 60 m, SGE, Australia)을 통해 화합물의 분리가 이루어지도록 하였다. 이러한 과정을 거쳐, 개별 성분들은 200^oC의 PFPD에서 검출이 이루어졌다.

2. 2. 2. Carbonyl compounds (CC)의 분석

여러 가지 종류의 카보닐화합물(carbonyl compounds; CC) 중에서 악취물질로 잘 알려진 AA (아세트알데하이드), PA (프로피온알데하이드), BA (뷰틸알데하이드), IA (i-발레르알데하이드), VA (발레르알데하이드) 및 주요 실내오염물질인 FA (폼알데하이드)를 중심으로 분석을 진행하였다. 이들을 HPLC/UV 기기로 분석하기위해, PEA bag으로 채취한 공기시료 중에서 8 L (1 L/min×8 min)를 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) 카트리지(TOP Trading Eng., Korea)에 흡수시켜 유도체화 하였다.⁹⁾ DNPH로 유도체화시킨 카보닐화합물은 acetonitrile과 증류수를 7 : 3의 부피비로 조제한 용리액을 바탕으로 비극성 column인 Acclaim120 C18 (particle size : 5 μm, diameter : 4.6 mm, length : 250 mm, Dionex, USA)을 적용하여 분리하였다. 이후에 UV 검출기(Spectra System UV2000, Thermo Scientific, USA)에서 360 nm의 파장으로 카보닐 성분들의 검출을 유도하였다. 

2. 2. 3. NH₃의 분석

암모니아(NH₃)의 분석은 시료를 발색시켜 흡광도를 측정하는 인도페놀법을 적용하여 분석하였다.³⁾  PEA bag으로 채취한 공기시료 중 NH₃의 농도를 정량하기 위해, 5% 붕산용액 50 mL에 미니펌프 (MP-∑300, SIBATA, Japan)를 이용하여 8 L (2 L/min×4 min)의 공기시료를 흡수시켜 주었다. 시료의 흡수가 끝난 붕산용액 중 10 mL를 분취하였다. 그리고 여기에 페놀-니트로푸르시드(phenol-nitroprusside) 용액과 차아염소산 나트륨 (sodium hypochlorite) 용액을 각각 5 mL씩 첨가하여, 약 1시간 동안 상온에서 발색을 유도하였다. 발색 시료는 635 nm의 파장에서 UV/VIS 분광계측기 (Model Genesys 10 series, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

2. 2. 4. TMA의 분석

트라이메틸아민 (Trimethylamine; TMA)의 분석은 1 L의 PEA bag에 공기시료를 옮겨서 SPME(Solid phase microextraction)방식으로 시료를 농축 후 분석하는 방법을 적용하였다.³⁾ 이를 위해, bag 내부에 polydimethylsiloxane/ divinylbenzene (65 μm film, Supelco, USA) 소재로 제조한 fiber를 30분 동안 노출시켜, TMA 성분의 흡착을 유도하였다. 그 후, SPME를 GC(GC 1000, Dani, Italy)의 주입구에서 250^oC로 5분간 열탈착시켰다. 분석을 위한 column은 아민류 분석에 용이한 CP 7448-volamin (film thickness: 1.8 μm, diameter: 0.32 mm, length: 60 m, Varian, USA)을 활용하였다. 그리고 300^oC의 온도 조건하에 TMA 성분을 고감도로 검출이 가능한 NPD (Nitrogen phosphorous detector)로 정량분석을 실시하였다. 

2. 2. 5. Volatile organic compounds (VOC) 및 volatile fatty acids (VFA)의 분석

휘발성유기화합물(volatile organic compounds; VOC) 및 유기지방산 (volatile fatty acids; VFA)의 분석을 위해, 8가지 VOC 성분들(B (벤젠), T (톨루엔), X (자일렌), S (스타이렌), MEK (메틸에틸케톤), MIBK (메틸아이소 뷰틸케톤), BuAc (뷰틸아세테이트), i-BuAl (i-뷰틸알코올))과 4가지 VFA 성분들(PPA (프로피온산), BTA (뷰틸산), IVA (i-발레르산), VLA (발레르산))을 조사대상으로 선정하였다. 이들은 흡착능이 다른 3종(Tenax TA, Carbopack X, Carboxen 1000)의 흡착제를 차례대로 충진한 3단 고체흡착관을 이용하여 시료를 채취하였다. 그리고 이를 열탈착분석기 (TD)와 GC (GC-2010, Shimadzu, Japan)-MS(mass spectrometer; GC MS-QP2010, Shimadzu, Japan)를 결합한 방식으로 분석하였다. 열탈착분석은 Carbopack B와 Carbopack C를 1 : 1의 부피비로 혼합한 cold trap (CT)을 이용하여, -10^oC에서 저온 농축을 유도하였다. 이들 시료는 다시 320^oC에서 열탈착을 유도한 후, GC 내에서 CP-Wax column (film thickness: 0.25 μm, diameter: 0.25 mm, length: 60 m, Agilent, USA)을 통해 분리를 유도하였다. 

2. 3. 공기희석관능법을 통한 희석배수의 산정

공기희석관능법은 악취를 유발하는 공기시료의 일정양을 무취공기에 단계별로 희석시킴으로써, 인체가 감지하지 못하는 임계수준까지의 희석배수를 산출하는 방법이다. 이 방식은 위에서 기술한 개별 악취물질들이 혼합물의 형태를 이룰 때, 악취의 강도를 복합적인 관점에서 판별할 수 있는 유용한 분석 기준에 해당한다. 개별 물질의 분석을 적용한 동일한 시료에 공기희석관능법을 적용하여, 인체가 느끼는 악취의 정도를 농도 자료와 함께 연계하여 활용할 수 있다.¹⁰⁾ 

희석배수의 산정을 위한 모든 과정은 악취공정시험 방법¹¹⁾에서 제시하는 방식을 바탕으로 실시하였다. 먼저, 공기희석관능법에 참여할 악취판정요원 5명을 악취 공정시험방법에서 제시한 기준에 따라 선정하였다.¹⁰⁾ 관능법에 사용할 무취공기는 일반 공기를 무취공기제조장치(TOP Trading Eng., Korea)의 흡수제 및 흡착제에 통과시키는 방식으로 제조하였다. 이러한 과정으로 제조한 무취공기는 3 L 용량의 냄새봉지 (Polyethylene telephtalate film)에 주입하고, 총 3개의 냄새봉지를 1인 판정요원의 감식을 위한 1 세트로 준비하였다. 그 후에, 악취성분을 포함한 시료의 일정량(처음에는 10 mL)을 3개의 냄새봉지 중 1개의 냄새봉지에 주사기로 주입하여 냄새를 희석시켰다(이 때의 희석배수: 300배). 이렇게 총 5세트를 준비하여 각각의 판정요원이 무취공기와 시료를 주입한 냄새봉지를 구분할 수 있는지 비교하게 해주었다. 이 때, 시료를 주입한 냄새봉지를 감식한 판정요원이 과반수를 넘을 경우 (5명 중의 3명 이상), 그 다음 단계의 희석배수를 약 3 또는 10배씩(1,000, 3,000, 10,000배) 증가시켜 주었다. 그리고 최종적으로 1명 이하 판정요원의 판별시점까지 실험을 진행해 나갔다. 반대로 과반수를 넘지 않았을 경우, 희석배수를 약 3배씩(100, 30배) 감소시키면서 과반수 이상이 맞출 때까지 계속해서 진행하였다. 5명의 판정요원으로부터 구한 각각의 희석배수는 최대∙최소값을 제외한 나머지 값들의 기하평균으로 처리하여 최종적인 희석배수로 산출하였다(즉, 복합악취의 희석배수가 높아질수록, 더 많은 무취공기로 희석을 실시하여야만 그 냄새를 감지하지 못하는 수준에 도달할 수 있다는 것을 의미한다). 이러한 희석배수를 수치 자료로 제공함과 동시에, 시료에서 발생하는 악취의 관능적인 특성을 “좋은 냄새”, “불쾌한 냄새”, “좋지도 나쁘지도 않은 냄새” 등으로 판정요원들이 주관적으로 감지한 냄새의 정보를 참고자료로 제시하였다. 

2. 4. 부패미생물의 오염도 및 성장 측정

삶은 계란이 부패하면서 생기는 악취를 유발할 수 있는 미생물에 대해 확인하였다. 채취된 시료 (0, 1, 3, 6, 9일)를 이용하여 각 총세균수를 Plate Count Agar(PCA, HiMedia Laboratories, India)로 확인한 후, 삶은 계란과 관련되어 있는 곰팡이 및 yeast 성장을 확인하기 위해 Selection Plate Method를 이용하여 Rose Bengal Chloramphenicol HiVeg Agar (RBC, HiMedia Laboratories, India)를 사용하였다. 또한 대기중 식중독과 관련된 미생물인 각 Bacillus, Coliform, & Staphylococcus균 측정확인을 위해 Eosin Methylene Blue Agar (EMB, Becton, Dickinson and Company, USA), Desoxycholate Lactose Agar (DLA, HiMedia Laboratories, India)와 Vogel and Johnson Agar (VJA, Becton, Dickinson and Company, USA)를 사용였다. 채취한 삶은 달걀 1 g을 9mL의 멸균된 희석용액(0.9% NaCl)과 함께 10배로 희석하였다. 그리고 이를 Stomacher (BagMixer W, interscience, France)로 2분 분쇄한 후, 선 멸균처리한 distilled water로 10²에서 10⁸까지 희석한 시료를 만들었다. 총 미생물 균수를 확인하기 위하여 PCA로 pourplating count를 이용하여 측정하였다. 곰팡이 또는 yeast는 RBC로 pour-plating count를 이용하여 측정하였다. 시료를 1mL씩 petri-dish에 분주하고 배지를 15mL 분주하고 굳힌 후 다시 5mL를 부어 굳혔다. 식중독균인 각 Bacillus, Coliform, & Staphylococcus균수의 확인은 EMB, DLA & VJA로 spread plating을 이용하여 식중독균의 존재유무를 확인할 수 있는 colony-color change에 의한 개별균수의 특성을 확인하였다. 모든 배지는 30^oC로 맞춘 incubator (HB-101M incubator, Han-Baek, Korea)에서 48시간 배양 후 colony counting을 하였다. 

3. 결과 및 고찰

3. 1. 신선한 시점에서 삶은 계란의 냄새특성 고찰

본 연구에서는 상온상태에서 갓 삶은 계란을 일정기간 (총 9일)에 걸쳐 보관하면서, 신선한 상태로부터 부패한 조건으로 변화하는 과정에서 발생하는 악취 성분들의 발생특성을 시간적 인자와 연계하여 경향성을 파악하고자 하였다. 이처럼 계란을 삶은 직후 (0일)의 신선한 상태에서 검출되는 냄새 성분들과 부패 과정에서 발생하는 악취성분들의 발생특성을 중점적으로 비교하였다. 실험을 진행하는 9일 동안, 총 5번의 시점에 확보한 시료로부터 측정한 복합악취의 희석배수 및 개별 악취 성분들의 농도 결과를 Table 3에 나타내었다.

Table 3. Summary of odorant concentration levels (ppb) measured from boiled egg sample for the duration of up to 9 days

이러한 결과를 살펴보면, 일반적으로 삶은 계란에서 황화합물, 카보닐화합물, 암모니아와 같은 성분들이 다른 성분들에 비해 고농도로 배출이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 전체 조사기간 동안 VOC, VFA, TMA 성분들은 대체로 검출한계 이하의 값을 보이거나, 수 ppb 이하의 낮은 농도 범위로 나타났다. 신선한 상태에서 냄새 물질들의 발생특성을 살펴보면, 계란을 삶은 직후(E-0)에는 H₂가 약 3.65 ppm의 최고 농도를 기록하며 다른 성분들보다 현저히 높은 농도를 나타냈다. 또한 CH₃SH와 같은 환원황화합물과, AA, PA, BA, VA 등을 포함한 카보닐화합물들이 7.52~50.8 ppb 수준으로 검출이 이루어졌다. E-0 시료의 희석배수는 총 5회의 분석 결과들 중에서 가장 높은 2,080배의 희석배수를 나타냈다. 카보닐 계열의 성분들은 최소감지농도가 약 1 ppb 수준 이하로 낮기 때문에,¹²⁾ 사람이 체감하는 냄새 강도 (복합악취: 희석배수 (D/T)의 세기에도 상당한 영향을 주었을 것으로 추정할 수 있다. FA와 NH₃ 성분은 각각 101, 304 ppb로 비교적 높은 농도분포를 기록하였다. 그러나 이들의 최소감지농도는 각각 500 ppb, 1.5 ppm이므로 E-0 시료에 대한 이들 성분들의 감지기여도는 미미한 것으로 판단된다. 이들 E-0 시료의 농도 값들로 미루어 볼 때, 음식물이 부패하는 단계가 아닌 삶은 직후의 신선한 상태에서도 고농도의 악취 성분들이 발생할 수 있으며, 그 냄새의 세기도 강하다는 것을 확인하였다. 이는 계란을 삶는 과정 중, 단백질의 염분해에 따른 황화합물 형성에 기인하는 것으로 사료된다.

3. 2. 시간의 경과와 부패단계에서 냄새물질의 발생특성

신선한 단계를 지나 시간이 경과하면서, 일시적으로 냄새 물질들이 감소하는 경향을 확인할 수 있다. E-0 시료에서 최고 수준의 발생량을 보였던 일부 황화합물(H₂S, CS₂)과 카보닐화합물 (FA, VA)들이 대부분 수 ppb 수준으로 감소하였다(E-1). 그러나, 계란을 삶은 후 3일이 경과한 시점에서부터 전반적으로 악취 성분들이 다시 증가하는 패턴을 보였다. 특히, CH₃SH와 AA의 농도는 각각 67.1, 75.4 ppb를 기록했다(E-3). NH₃ 성분도 최소감지농도(1.50 ppm)를 상당히 초과하는 수준의 농도(3.90 ppm)를 나타냈다. 이러한 증가 경향성은 6일경과 시점에서 대부분의 성분들이 최고 농도를 기록하는 양상을 보였다. 카보닐화합물들(FA, AA, PA, BA)은 20~50 ppb 범위로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 황화합물 중에서는 H₂S와 DMS가 다시 50 ppb 이상으로 농도가 증가하는 경향을 보였다. E-9 시료에서는 H₂S, FA, VA와 같은 성분들은 농도가 다소 높은 농도를 보였지만, 이들을 제외한 대부분의 악취 성분들의 농도는 감소하는 패턴을 보였다. 이런 관점에서 NH₃는 E-9 시료에서 최고치를 기록한 것은 특이한 경향으로 볼 수 있다. 이러한 현상은 삶은 계란 내부의 미생물이 음식물을 분해하는 과정에서 악취 성분들의 배출을 증가시켰을 것이라 추정한다.¹³⁾ 

삶은 계란의 부패 과정에서 악취 성분들의 발생특성을 중점적으로 비교해 보기 위하여, 그룹별로 분류한 결과를 Fig. 2에 제시하였다. 이 때, 총 5회 분석한 농도 결과가 모두 검출한계 이하의 값을 보인 성분들(B, S, BuAc, i-BuAl, PPA)은 그림에서 제외하였다. 전체 조사기간 동안 냄새 물질들의 발생특성을 경시적 관점에서 살펴보면(Fig. 2), 황화합물은 1일 경과시까지 농도가 감소하다가 그 이후부터 다시 증가하는 경향을 확인할 수 있다. 이 때, H₂S는 실험 종료시점인 E-9 시료 (123 ppb)에 비해 최초의 시료 E-0 (3,655 ppb)에서 현저하게 더 높은 최고치를 기록하였다. 일반적으로 H₂S는 “계란 썩는 냄새” 등으로 잘 비유하지만, 본 연구의 결과에서는 계란이 썩는 과정보다 계란을 삶은 직후(신선한) 상태에서H₂S가 최고 농도를 기록하였다. 이러한 특성은 삶은 메추리알의 부패악취를 연구한 사례에서도 확인할 수 있다.⁶⁾ 삶은 메추리알에서 발생하는 H₂S도 한 달 동안의 경시변화 중에서 삶은 직후 상태일 때, 가장 높은 농도(약 50 ppb)로 검출이 이루어졌다. 

Fig. 2. Temporal changes in log concentration of odorants released from boiled egg sample as a function of time (Concentration of B, S, BuAc, i-BuAl, and PPA excluded).

황화합물 중에서 H₂S와 더불어 CH₃SH도 3일 경과시점 이후부터 비교적 고농도로 발생하며, 주요한 악취 원인물질로 작용하였음을 추정할 수 있다. VOC 성분들은 다른 성분들에 비해 배출량도 적었으며, 경시변화에 대한 농도 증감의 폭도 적었다. 유일하게 MEK가 1 ppb 이상의 농도 범위를 유지하고, MIBK도 미량이지만 모든 시료에서 검출이 이루어졌다(Table 3). 즉, 삶은 계란에서 발생하는 VOC 성분들 중에서는 케톤 계열 성분들의 비중이 상대적으로 높은 것을 알 수 있었다. IA를 제외한 카보닐화합물은 대체로 3일 경과시점까지 농도가 감소하다가 6일부터 급격히 증가하는 경향을 보였다. 전체 조사기간 동안 AA 성분은 20.8~103 ppb의 범위 내에서 지속적으로 배출이 이루어졌다. 또한 FA도 삶은 계란의 신선한 상태와 부패 마지막 단계에서 50 ppb를 초과하는 고농도를 기록했다 (Table 3). 질소계화합물(NH₃, TMA) 중에서, NH₃는 시간이 경과할수록 농도가 지속적으로 증가하였다. 삶은 직후 신선한 상태에서는 NH₃의 농도가 304 ppb로 비교적 낮은 수준이었지만, 마지막 시료채취 시점에는 32.2 ppm을 기록하며 백 배 이상의 증가를 보였다(Table 3). 반면에, TMA는 E-1 시료에서만 미량(1.81 ppb)으로 검출이 이루어지고, 전반적으로 검출한계 이하의 값을 유지하였다. VFA 성분들은 계란을 삶은 직후(E-0)에만 극미량 검출이 이루어지고, 나머지 시점에서는 모두 검출한계 이하를 나타냈다. Fig. 3(A)에 제시한 결과에서도 전반적으로 삶은 계란이 부패 단계를 거치면서, 황화합물, 카보닐화합물, NH₃의 농도가 뚜렷하게 증가하는 경향을 확인할 수 있다.

Fig. 3. Distribution of log concentration and odor intensity (OI) values for the all target compounds measured in this study.

삶은 계란에서 발생하는 냄새 물질들의 발생특성을 다양한 종류의 음식물과 비교해 보기 위하여, 선행연구의 결과들과 비교 제시하였다(Table 4). 그 중에서 Kim 등(2009)은 본 연구와 유사한 조사 대상인 삶은 메추리알에서 발생하는 부패악취를 한 달의 경과기간 동안 10차례 비교하였다.¹⁴⁾ 그 결과, 일부 황화합물(CH₃SH, DMDS), 카보닐화합물(AA, PA), NH₃ 성분은 조사기간 동안 평균적으로 수~수백 ppm 수준으로 높은 농도 값을 유지하였다. 이러한 경향은 본 연구 결과와도 잘 일치한다. 반면에, 선행연구의 결과에서 T와 S 성분은 각각 2.25, 8.24 ppm, TMA는 600 ppb의 농도 분포를 보이면서, 본 연구에서 VOC, TMA 성분들이 미미하게 나타난 것과 차이를 보였다. 본 연구의 비교사례로 여러 종류의 음료(맥주, 와인, 우유)로부터 발생하는 황화 합물들을 조사한 연구^15-17)를 참조할 수 있다. 이들 연구에 의하면, H₂S, CH₃SH, DMS 성분들이 2.92~67.5 ppb 범위 내에서 검출이 이루어진 것을 확인하였다. 이들 결과 중 CH₃SH와 DMS는 삶은 계란에서 발생한 농도와 비슷하고, H₂S는 삶은 계란의 결과보다는 현저히 작은 수준임을 나타냈다. 치즈에서 발생한 H₂S (150 ppb)의 양은 삶은 계란이 부패하는 과정(E-6: 101, E-9: 123 ppb)에서 배출한 농도와 유사한 값을 보였다.^18-20) 신선한 날고기 상태의 닭고기, 쇠고기, 돼지고기에서는 수 십 ppb의 수준으로 황화합물, VOC 성분들, 카보닐화합물이 발생한 것을 알 수 있다.^6,19,21,22) 이들 중 신선한 상태의 쇠고기가 부패의 과정을 거치면, 일부 성분들(H₂S, CH₃SH, DMDS, FA, AA, PA, NH₃)의 농도가 수~수백 ppm 범위로 매우 크게 증가한 사례를 확인 할 수 있다. 특히, VOC 성분들의 농도도 4,240 (T), 310 (X), 320 (S) ppb의 값을 보이며, 본 조사 대상인 삶은 계란의 VOC 분석 결과와는 큰 차이를 나타냈다. 이와 유사한 경향성은 신선한 상태와 부패한 생선 시료에서도 확인할 수 있다.^14,23) 덧붙여, 생선은 부패하면서 TMA의 발생특성이 두드러지게 나타났다. 신선한 과일에서 발생하는 냄새 물질들을 조사한 결과에서는 일부 카보닐화합물(AA, PA, BA)과 ester 및 ketone 계열 화합물이 수 십 ppb 수준으로 검출 가능한 것으로 나타났다.^2,24-26) 

Table 4. Comparison of different studies for odorant emissions (ppb) from food samples

3. 3. 악취강도로의 환산

기기분석을 통해 도출한 개별 성분들의 농도 결과를 함수식¹²⁾에 대입하여 악취강도 (Odor intensity; OI)로 환산하였다 (Table 5). 환산을 위한 함수식이 존재하지 않는 CS₂와 B는 환산 과정에서 제외하고, 음의 악취도를 나타낸 성분들은 NC(Not calculated)로 표기하였다. 악취강도는 1~5도의 범위로 나눌 수 있으며, 간신히 느낄 수 있는 냄새(1), 무슨 냄새인지 알 수 있는 냄새(2), 쉽게 느낄 수 있는 냄새(3), 센 냄새(4), 강렬한 냄새(5도)와 같이 구분할 수 있다. 악취도 결과를 살펴보면, 고농도의 발생량을 보였던 황화합물과 일부 카보닐화합물, NH₃의 악취기여도가 높은 것으로 나타났다(Fig. 3(B)). 주로 H₂S, CH₃SH, AA, BA, NH₃와 같은 성분들이 2~4도의 악취도를 보인 것으로 미루어 보아, 이들은 삶은 계란의 부패과정에서 악취의 기여도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 

Table 5. Odor intensity (OI) formula for each odorant and the resulting OI values

위와 같은 과정으로 도출한 개별 성분들의 악취도를 악취강도의 합(Sum of odor intensity; SOI)으로 나타내고, 이를 대략적인 추정을 위해 공기희석관능법에 의한 희석배수와 연계하여 평가해 보았다. 이를 위해서, 식 (1)과 같이 개별 성분들의 악취도(OI)를 합한 값에 Log를 취하여 SOI 값을 산출하였다.²⁷⁾ 

 SOI=Log{10^OI(i)1 +10^OI(i)2 +10^OI(i)3 + ... +10^OI(i)25 }
(i=25가지 개별 성분들의 악취도)                           (1)

5가지 시료들에 대한 SOI 값은 각각 4.72 (E-0), 2.79 (E-1), 4.59 (E-3), 4.75 (E-6), 5.06 (E-9)을 기록하였다. 그리고 희석배수는 2,080 (E-0), 300 (E-1), 300 (E-3), 669 (E-6), 300 (E-9)을 나타냈다. 판정요원들이 감지한 각 시료들의 냄새 특성을 바탕으로 희석배수와 SOI를 연계하여 비교해 보면, 전반적으로 증감의 경향이 잘 일치하는 성향을 볼 수 있다 (Fig. 4(A)). E-0은 모든 시료들 중에서 희석배수가 가장 높았고, SOI 값(4.72)도 비교적 높은 수준이었다. 이러한 수치 자료로부터 인체가 감지하는 악취세기는 강할 것이라 추정할 수 있지만, 판정요원들은 E-0 시료에 대해 냄새 특성을 “좋은 냄새”로 분류하였다. E-0의 공기시료에는 본 연구에서 조사 대상으로 선정한 악취 성분들과, 다른 종류의 냄새 물질들을 동시에 포함하고 있을 것으로 사료된다. 1일이 경과했을 때 채취한 E-1 시료의 희석배수(300)와 SOI 값(2.79)은 크게 감소하였다. 또한 판정요원들은 E-1에 대해 “좋지도 나쁘지도 않은 냄새”로 구분하였다. E-3의 희석배수는 E-1과 같은 값을 유지하였지만, SOI 값(4.59)은 다시 증가하는 패턴을 보였다. 이를 E-3의 냄새 특성과 연계해 보면, 판정요원들은 3일 경과시점부터 썩는 냄새를 감지하기 시작하고, “불쾌한 냄새”로 특징지었다. 이와 더불어, E-6과 E-9에 대해서도 동일한 냄새의 특성(불쾌한 냄새)을 감지하였다. 이 때의 SOI 값도 지속적으로 증가하며, 삶은 계란의 부패 단계가 진행 중임을 추측할 수 있다.

Fig. 4. Comparison of resulting patterns between D/T ratio and two variables (SOI and log (H₂S)) measured during boiled egg decay experiment.

3. 4. 개별 악취성분들의 상관분석 결과

삶은 계란의 신선한 상태와 부패 단계에서 발생하는 개별 악취물질들간의 관계 및 이들과 희석배수 사이의 통계적 유의성을 비교해보기 위해, 상관분석을 실시하였다 (Table 6). 상관분석은 두 가지의 변수 (농도 값과 악취강도)를 이용하여 각각 진행하였다. 이 때, 모든 시료에서 검출한계 이하의 값을 보인 5가지 성분들(B, S, BuAc, i-BuAl, PPA)과 모든 시료에서 극미량(1 ppb 이하)의 검출이 이루어진 9가지 성분들(CS₂, T, p-X, m-X, o-X, MIBK, BTA, IVA, VLA)은 상관분석에서 제외하였다. 농도 값을 이용한 상관분석을 살펴보면(Table 6(A)), 희석배수(D/T-ratio)는 유일하게 H₂S와 강한 상관성(p=0.003)을 보였다. 실제로 희석배수와 H₂S의 농도 결과를 비교해보면, H₂S 농도의 고저에 따라 희석배수의 증감도 매우 유사한 패턴을 보인다는 것을 알 수 있다(Fig. 4(B)). 이 밖에도 5개의 p값이 0.05 이하의 비교적 강한 상관성을 유지하였다(DMDS와 CH₃SH, AA, DMS와 MEK, BA와 MEK, PA). 그러나 이와 같은 성분들과는 다르게, 질소계화합물들 (NH₃, TMA) 사이에서는 의미있는 상관성을 확인할 수 없었다.

Table 6. Result of correlation analysis between each odorant : (A) concentration and (B) odor intensity obtained in this study

그 다음으로, 희석배수와 모든 성분들의 악취강도 사이에서는 강한 상관성을 찾을 수가 없었다(Table 6 (B)). 이를 감안하면 희석배수와 H₂S의 농도 값의 연관성은 특이한 사례의 유형으로 볼 수 있다. 악취강도의 상관분석 결과는 2개의 p값(DMS와 AA, VA와 TMA)에서 0.01 이하의 값을 보이며, 매우 높은 수준의 상관성을 나타냈다. 이 외에도 6개의 악취물질들(AA와 CH₃SH, VA, TMA, CH₃SH와 DMS, TMA, IA와 PA)과 p 값이 0.05 이하를 기록하며, 비교적 강한 상관성을 보였다. 공기희석관능법에 의한 희석배수와 개별 성분들간의 농도 값과 악취강도를 이용한 상관분석 결과, 희석배수는 유일하게 H₂S의 농도와 강한 상관관계를 형성하였다. 반면에 개별 성분들을 중심으로 살펴보면, 농도 값보다는 악취강도 사이에서 강한 상관성을 지닌 성분들이 다수 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과를 선행연구와 살펴보면, 신선한 상태의 생선에서 발생한 악취 성분들 중에서 H₂S와 CH₃SH의 농도가 p〈0.05 이하의 강한 상관성을 나타냈다.⁷⁾ 또한 치즈에서 발생하는 악취 성분들과 악취도의 관계를 살펴보면, H₂S, CH₃SH, DMS, BTA와 같은 성분들은 p〈0.01 이하의 상관성을, 그리고 AA, MEK와 같은 성분들은 p〈0.05 이하의 상관성을 유지하였다.¹⁸⁾ 이와 유사하게 H₂S의 농도와 우유에서 유발하는 냄새의 상관 관계가 크다는 사례도 찾아볼 수 있다.²⁰⁾ 

3. 5. 계란에서 배양된 미생물의 확인

삶은 계란의 부패실험 중 검출된 총세균수는 삶은 직후(E-0)에선 미생물의 오염이 없으나, 대기 중 노출과 함께 미생물의 오염이 시작하여 3일이 경과한 후 미생물이 급격히 성장하는 것을 확인하였다. 6일째(E-6) 최대 총균수를 보이고 9일째(E-9)에서 다소 줄어드는 것으로 나타났다 (Fig. 5). 일반적으로 미생물의 성장과 함께 삶은 계란이 부패하면서, 단백질 분해물인 황화합물 및 질소화합물의 생성과 함께 악취가 증가하는 것을 확인하였다. 오염된 미생물의 종류를 확인하기 위하여 Selection Plate Assay분리를 이용하여 검증한 결과 삶은 계란은 대기노출 후 곰팡이의 성장이 급격하게 증가하고(〉10⁴, 1~3 days), 미생물 오염 중 단백질 분해력을 가지고 있는 곰팡이가 삶은 계란을 오염해 부패를 유발하는 것으로 나타났다. 이러한 이유는 계란을 삶음과 동시에 표면 water activity (wa)가 떨어져 세균의 성장이 상대적으로 억제된 것으로 여겨진다. 일반적으로 식품 내 미생물의 성장은 wa와 밀접한 관계를 가지게 되는데, wa〈0.9일 경우 원핵 미생물의 성장이 억제된다. 단백질 분해력을 가진 미생물의 성장은 단백질의 부패와 함께 황화합물질 및 질소화합물의 생성과 일치하는 것으로 확인되었다. 반면 사람을 매개로 식중독을 유발하는 Bacillus, Coliform, & Staphylococcus 등의 미생물은 초기에는 기대한 것과 마찬가지로 삶은 직후 오염이 되지 않아 시간이 지나며 서서히 자란 것으로 사료된다. 보다 구체적으로 곰팡이가 성장과 더불어 영양물질의 공급과 함께 서서히 성장하였다가(〈10², 0~6 days) 곰팡이의 성장이 둔화되는 9일 이후 급격히 성장하는 것으로 나타났다(〉10⁸).

Fig. 5. Total microorganism counting on PCA and RBC of boiled egg following spoilage.

4. 결 론

본 연구에서는 신선한 상태의 음식물들이 미생물에 의한 부패의 과정을 거치면서 발생하는 악취 성분들의 배출특성을 파악해 보고자 하였다. 이를 위하여 삶은 계란을 조사 대상으로 선정하고, 총 9일의 조사 기간동안 총 5회에 걸쳐 발생 가능한 냄새 물질들의 농도 변화를 시간의 경과에 따라 비교분석하고자 하였다. 분석 대상 성분으로는 악취방지법에서 지정한 22가지 지정악취물질 및 기타 주요 악취물질들 (carbon disulfide, benzene, formaldehyde)과, 공기희석관능법을 통한 복합악취의 희석배수를 참고 자료로 활용하기 위하여 추가적으로 조사하였다. 전체 조사 기간 동안, 삶은 계란에서 검출 가능한 악취 성분들 중에서 황화합물, 카보닐화합물, NH₃의 발생량이 상대적으로 높은 수준을 유지하였다. 그러나, 신선한 상태에서 부패 단계로 변화하면서 개별 성분들마다 다른 경향의 농도 변화를 나타냈다. 계란을 삶은 직후의 신선한 상태에서는 H₂S가 약 3.65 ppm의 수준으로 발생하며, 다른 성분들보다 현저히 높은 농도 값을 기록했다. 그 다음으로는 CH₃SH, AA, PA, BA, VA와 같은 성분들도 7.52~50.8 ppb 수준으로 검출이 이루어졌다. 신선한 단계를 지나 시간이 경과하면서, 냄새 물질들은 일시적으로 발생량이 감소하는 경향을 나타냈다. 그러나, 계란을 삶은 후 3일이 경과한 시점에서부터 전반적으로 악취 성분들이 다시 증가하였으며 악취성분의 발생은 미생물 (특히, 곰팡이 및 yeast)의 성장과 밀접한 관계를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 증가 경향성은 6일 경과 시점에서 대부분의 성분들이 미생물의 성장과 함께 최고 농도를 기록하는 양상을 보였다. 일부 카보닐화합물들 (FA, AA, PA, BA)의 농도는 20~50 ppb 범위를 유지하였다. 또한 황화합물 중에서는 H₂S와 DMS가 다시 50 ppb 이상으로 농도가 증가하는 경향을 보였다. 개별 성분들의 분석 결과, 계란이 부패하는 단계에서보다 계란을 삶은 직후인 신선한 상태에서 H₂S의 농도가 최고치를 기록하였다는 것은 특이한 사례에 해당한다. 이와 같은 H₂S의 농도 고저에 따라 희석배수 (D/Tratio)의 증감도 매우 유사한 패턴을 보였다. 실제로 공기희석관능법에 의한 희석배수는 실험 종료시점의 희석배수(300)보다 신선한 상태의 계란 시료에서 더 높은 값(2,080)을 나타냈다. 이들의 상관분석 결과도 p=0.003을 보이며, H₂S의 농도와 희석배수 사이의 강한 상관성을 확인할 수 있었다. 삶은 계란의 오염을 유발하는 미생물로는 삶은 계란의 표면 water activity가 적은 특성상 단백질 분해력을 가지고 있는 곰팡이가 주된 원인이라는 점을 확인할 수 있었다. 식중독을 유발 할 수 있는 Bacillus, Coliform, & Staphylococcus 등과 같이 사람을 매개로 하는 미생물들은 초기에는 오염을 유발하지 않았으나 시간이 지나 곰팡이의 성장이 둔화되는 9일 이후 급격히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 미생물의 성장과 함께 삶은 계란이 부패함으로써 단백질 분해물인 황화합물질 및 질소화합물이 생성
되어 악취가 증가하는 것을 확인하였다. 삶은 계란의 경우 대기 중 미생물의 성장이 식품의 안정성보다는 일반적으로 악취발생에 따른 식품의 질적 손실에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이와 같은 결과들을 종합적으로 살펴볼 때, 다양한 종류의 음식물에서 발생 가능한 악취 성분들을 규명하기 위한 노력이 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다. 식품의 부패와 함께 발생하는 악취는 식품의 저장 중 저장상태를 확인할 수 있는 지표로 사용할 수 있어, 악취성분의 정량, 정성분석은 식품의 저장관리 기준으로 사용할 수 있다. 더 나아가 이러한 연구들을 적절하게 활용함으로써, 주요 생활악취 배출원인 음식물의 부패악취를 저감하기 위한 노력도 동시에 필요할 것으로 판단된다.

사 사

이 논문은 2009년도 정부 (교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2009-0093848).